Uma nova análise quantitativa direcionada de X

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12856 (2023) Citar este artigo

Detalhes das métricas

As análises de inativação do cromossomo X (XCI) muitas vezes auxiliam no diagnóstico de características ligadas ao X, no entanto, a avaliação precisa permanece um desafio com os métodos atuais. Desenvolvemos uma nova estratégia usando enriquecimento Cas9 livre de amplificação e sequenciamento de tecnologias Oxford nanopore chamado XCI-ONT, para investigar e quantificar rigorosamente XCI no gene do receptor de andrógeno humano (AR) e no gene da retinite pigmentosa 2 ligada ao X humano (RP2). O XCI-ONT mede a metilação acima de 116 CpGs em AR e 58 CpGs em RP2, e separa os cromossomos X parentais sem viés de PCR. Mostramos a utilidade da estratégia XCI-ONT sobre a técnica padrão ouro XCI baseada em PCR que investiga apenas um ou dois CpGs por gene. Os resultados destacam as limitações do uso da técnica padrão ouro quando o padrão XCI é parcialmente distorcido e as vantagens do XCI-ONT para quantificar rigorosamente o XCI. Este estudo fornece um método XCI universal em DNA, que é altamente valioso na estrutura clínica e de pesquisa de características ligadas ao X.

A inativação do cromossomo X (XCI) é um mecanismo de compensação para a diferença no número de cromossomos X entre homens (46XY), mulheres (46XX) e indivíduos com aneuploidias X1. O mecanismo molecular humano da XCI não é completamente compreendido2,3, mas estudos demonstraram que a XCI é controlada por fatores de ação cis e de ação trans no centro de inativação do X (Xic), incluindo a expressão gênica do transcrito específico inativo do X (XIST) e genes transcritos específicos ativos para X (XACT)3. Isto eventualmente leva à expressão monoparalela e ao acúmulo de H3K27me33 e metilação de locais CpG próximos a promotores de genes no cromossomo X inativo (Xi) (Fig. 1A) . A metilação tem se mostrado importante para a manutenção do estado inativo de Xi7,8,9,10. A XCI em humanos é iniciada no estágio inicial de implantação embrionária3, e a escolha de qual cromossomo X a ser inativado é em geral descrita como um processo aleatório, onde ambos os cromossomos X estão igualmente representados11,12. No entanto, observou-se que a inativação preferencial de um cromossomo X, chamada XCI distorcida, modifica a manifestação da doença ligada ao X em mulheres portadoras, indicando que o genótipo é importante na escolha do cromossomo X ativo (Xa), possivelmente por seleção de células devido a uma desvantagem de células mutantes13,14,15,16. Em primeiro lugar, o silenciamento preferencial do alelo patogénico tem sido associado a uma sobrevivência feminina selectiva ou a um efeito menos grave de características ligadas ao X. Demonstrou-se que a distorção extrema é um bom indicador da presença de variantes patogênicas ligadas ao X em mulheres portadoras15,17,18 e as análises de XCI em parentes da família, portanto, muitas vezes auxiliam na interpretação de variantes ligadas ao X. Em segundo lugar, a expressão do alelo patogênico pode levar à manifestação de fenótipos em mulheres portadoras de características ligadas ao X19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 e pode explicar diferenças fenotípicas observadas em mulheres portadoras afetadas e indivíduos com aneuploidias X21,24,29,30,31,32,33,34,35,36. É digno de nota que recomenda-se que as análises XCI sejam realizadas em tecidos relevantes, em diferentes idades e em não fumantes37,38,39,40,41,42,43,44. Em geral, a definição de assimetria tem sido > 80:20, mas devido a limitações na técnica padrão ouro usada para análise XCI, a quantificação da assimetria não tem sido recomendada para silenciamento diferente de 100:0, destacando a necessidade de um método quantitativo .

(A) Esquema do mecanismo de inativação do cromossomo X e seu efeito em mulheres portadoras de características ligadas ao X. Azul: cromossomo X ativo (Xa), vermelho: cromossomo X inativo (Xi), estrela amarela: variante patogênica ligada ao X. Ilustrações criadas usando o Adobe Illustrator 2022 (disponível em https://adobe.com/products/illustrator). (B) Os métodos padrão ouro XCI utilizam enzimas de restrição sensíveis à metilação (HpaII) que cortam o Xa, mas deixam o Xi intacto. HpaII tem como alvo dois e um sítio CpG no receptor de andrógeno (AR) e Retinis pigmentosa 2 (RP2), respectivamente, e é seguido por PCR e análise de comprimento de fragmento (FLA) abrangendo regiões repetitivas polimórficas (CAGn ou GAAAn) que separam os alelos parentais. Ilustrações criadas no Adobe Illustrator 2022 (disponíveis em https://adobe.com/products/illustrator). A abordagem XCI-ONT corta o DNA independente do status de metilação usando o enriquecimento CRISPR-Cas9 com três gRNAs (rosa) flanqueando uma região de interesse (ROI) de ~ 3 kb abrangendo 116 locais CpG em AR e 58 locais CpG em RP2. (C) XCI-ONT inclui: (1) Desfosforilação das extremidades 5' para reduzir a ligação de adaptadores de sequenciamento a cadeias fora do alvo. (2) O sistema CRISPR-Cas9 se liga e corta o ROI, e o DNA tem cauda dA para ligação do adaptador aos lados cortados de Cas9, que são ambos com cauda 3' dA e 5' fosforilados. (3) A biblioteca é sequenciada usando Oxford Nanopore Technologies e chamada de base Bonito. (4) Chamar repetições alinhando as leituras aos genomas de referência contendo todas as repetições possíveis nas regiões, e as leituras são divididas em haplótipos traçando o número de leituras com repetições diferentes. Por último, a chamada e quantificação da metilação são realizadas usando Nanopolish, e os dados são visualizados usando o Integrative Genomics Viewer (IGV). A metilação média do ROI é calculada e a razão XCI entre os dois cromossomos X é determinada.